芯片上的患者—多器官串聯芯片Multi-Organ-on-Chip應用于精準醫療

翻譯整理：北京佰司特科技有限責任公司

An Individual Patient's "Body" on Chips – How Organismoid Theory Can Translate Into Your Personal Precision Therapy Approach

Frontiers in Medicine, 2021, Vol. 8

Marx U, Accastelli E, David R, Erfurth H, Koenig L, Lauster R, Ramme AP, Reinke P, Volk HD, Winter A, Dehne EM

類有機體的概念在12年前就被提出來，當時被稱為“芯片上的人體human-on-a-chip"或“芯片上的身體body-on-a-chip"，從“多器官串聯芯片Multi-Organ-on-Chip"發展而來，將多個類器官串聯起來培養。微生理系統MPS成為體外在生物學上可接受的最小尺度模擬人體生理和形態的技術平臺，因此，微生理系統能夠精度為每個患者篩選出個性化治療方案。與此同時，第一個人類類器官——干細胞衍生的復雜三維器官模型，可以在體外擴增和自我組織——已經證明，只要給人類干細胞提供相應誘導分化及生長環境，就可以在體外自我組裝成人體類器官。這些早期的類器官可以精確地反映出人體中對應器官的一系列生理狀態和病理特征。我們現在把過去的“芯片上的人體human-on-a-chip"的概念發展成“類有機體Organismoid"的理論。首先，我們提出了“類有機體"的概念，即通過體外的自我組裝的過程，模仿個體從卵細胞到性成熟的發生過程，培養出的——微小的、無思維、無情感的體外的人體等效物。隨后，我們提出了類有機體的分化和培養方法，使其能在體外長時間維持正常功能，以及通過自然或人工誘發疾病干擾類有機體來模擬個體疾病過程。最后，我們討論了如何使用這一系列健康和疾病模型的類有機體來代替病人，測試藥物療效或藥物劑量，即個體化精準醫療。

圖1 |每個人個體命運的類有機體。(A）個體發育（黃色）從卵細胞受精開始，隨后出生，并在18 ~ 20年后性成熟，發育出功能完整的大腦和成年骨骼。然后，成人的身體會經歷一個持續數十年的功能和結構相對穩定的階段。隨著身體年齡的增長，這個成年期會被不斷延長的生病和康復期打斷（粉色）。情感和意識——人類的靈魂和思想——從童年開始連續發展，并貫穿一生。（B）根據類有機體理論，個性化的類有機體可以通過持續幾個月的體外培養（黃色）來建立。由此產生的成體類有機體可以模擬健康人類成年幾周（S-短期）、幾個月（M-中期）或幾年（L-長期）的階段。然后，這些可以用來模擬急性、亞慢性和慢性疾病時期（粉色）和個體在相應的時間框架內的治療后恢復。大量相同的類有機體還可以提供足夠數量的生物學重復和對照，確保了數據的準確性，真實性，可重復性。此外，這些健康的類有機體在預防醫學的評估方面很有用，比如為各自的個體接種疫苗。

類有機體理論

人的個體壽命的特征是人體的生理和形態的發育階段（發育期）和功能維持階段（成年期），以及個體與社會在靈魂和思想上的雙向交流，如圖1A所示。

社會起源本質上與人的大腦的大小和結構有關——大腦由大約860億個神經元以及數量大致相等的非神經元細胞（2）組成，這些細胞高度連接，聚集在一起處理、整合和協調它從感覺器官接收到的信息（3）—以及它與身體其他部分的相互聯系。成熟的人體生理遵循一個簡單的進化，即選擇性結構計劃，也就是組成遵循功能。早在2007年，我們就注意到這樣一個事實:“……幾乎所有的器官和系統都是由多個相同的、功能獨立的結構單元組建成的，從幾個細胞層到幾毫米組織。由于其能性、高度的自立性和這些結構單元在各自器官中的多樣性，它們對藥物和生物制劑的反應模式幾乎代表了整個器官。大自然創造了這些微小但復雜的結構單元，以實現器官和系統最主要的功能。在一個特定的器官內，這些結構的重復是天然的風險管理工具，以防止器官局部損傷時功能喪失。然而，從進化的角度來看，這一概念使得器官的大小和形狀可以很容易地調整到特定物種的需要（例如，小鼠和人類的肝臟使用幾乎相同的結構單元）（4）。這一理論，結合微生理系統（MPS）的發展，為在生物芯片上以生物學上可接受的最小尺度模擬人體的器官提供了理論基礎（5-7）。2012年，我們引入了“芯片上的人體"（man-on-a-chip）的概念，從“多器官串聯芯片Multi-Organ-on-Chip"發展而來，即將多個類器官（比體內縮小10萬倍）串聯起來培養。我們舉例說明了人體主要器官的功能單位，并簡要描述了減小尺寸的原理（5）。這是發展一種理論的起點，即建立一種微小的、無思維、無情感的體外的人體等效物，我們現在稱之為organismoids類有機體。不同的術語，如芯片上的人體，芯片上的身體，或通用的生理模板，在過去已經被用于代表有機體。在MPS領域中已經使用過這個概念，通過培養10個人的主要器官的等效物（類器官）來實現完整的體內平衡：循環，內分泌，胃腸道，免疫，皮膚，肌肉骨骼，神經，生殖，呼吸和泌尿系統。

基于芯片，串聯培養這些器官模型的系統構成了最小的有類有機體，MPS領域預測至少還需要10年才能在芯片上建立這樣的功能性類有機體（8，9）。可以用來模擬單個患者的疾病和健康狀態，如圖1B所示，從而能夠為每個患者精確選擇正確的藥物或療法和用藥方案。除了用于精準醫療之外，從選定的患者中提取的生物樣本還可以進一步用于在芯片上進行臨床試驗。2018年，毒理學研究前沿論壇（Investigative Toxicology Leaders Forum）討論了在細胞模型中模擬人類生理學的潛力，該論壇聚集了14家歐洲制藥公司的代表（圖2）（10）。

類有機體的理論基于兩個按時間順序相互關聯的概念，每個概念有三個實施原則。類有機體的體外發育依賴于（i）（誘導多能）干細胞為基礎的體外早期類器官形成；（ii）以生理學為基礎，通過血液灌流和神經分布，應用于芯片上的MPS，將此類早期器官的比例/數量整合為早期自我維持的類有機體；以及(iii)通過類器官在芯片上的串聯培養加速刺激個體發育，完成體外個體發育成為健康成熟的類有機體（模擬成年期）的轉變。

因此，利用芯片上的類有機體模擬病人的疾病和治愈過程的概念遵循以下原則：（一）通過自然疾病過程或通過來自病人的病原體或病變組織的傳播在生物體中誘發疾病；（ii）通過對同一個患者來源的健康和病變類有機體進行相同數量的試驗來模擬對大量患者進行的人體臨床試驗；以及（iii）為每個患者精確選擇正確的藥物或療法和用藥方案。

在這篇文章中，我們帶你通過類有機體理論的概念和原則，用實際結果闡述它對我們的醫療保健系統的性創新的潛力，并提供一個可行性方法的展望。

干細胞和患者來源的類器官教會了我們什么?

一個多世紀以來，科學家們一直對導致體內組織特異性形態發生和器官發生的生化和生物物理線索著迷不已。由于缺乏更多與生理相關的測試系統，他們的研究僅限于經典的細胞培養和動物模型。這些模型極大地增強了我們對細胞功能和疾病機制的基本認識。然而，如何將這些結果轉化為人體的數據已經成為一個嚴重的難題。最近干細胞研究和三維（3D）培養系統的進步已經產生了一種有希望的復雜和人源的模型，稱為類器官。這些類器官由多能干細胞（PSCs）（誘導PSCs [iPSCs]或胚胎干細胞)、成體干細胞（ASCs）或成體腫瘤組織通過自組織產生。它們在藥物發現和個性化醫學中的應用已經被驗證（11），并提供了生成個性化數據的第一個概念證明（12）。

類器官組織保持其持續增殖和分化為各自器官的不同細胞類型的能力，同時通過仔細調整微環境線索，如模擬體內干細胞生態位，保存干細胞庫。與二維單層培養相比，3D類器官培養更緊密地模擬了基因和蛋白質表達以及代謝能力所顯示的器官的生理行為。大多數類器官都需要一個基于層粘連蛋白的細胞外基質環境。 而膠原蛋白，相當于體內細胞周圍的物理支架。在大多數情況下，這種基質是來源于動物的，沒有明確的指標，因此，可能會出現批次到批次的變化（13）。此外，類器官（ASC-或PSC -衍生）的分化過程取決于許多不同的因素，如生長因子、基質、基質剛度、細胞-細胞接觸、細胞密度、氧水平、營養供應或體外自組織和細胞命運決定的隨機性。因此，在標準的離體培養條件下，類器官的成熟和功能存在高度的異質性。

PSCs衍生的類器官在體外模擬胚胎發育。因此，這些類器官在發育研究中具有重要價值。利用不同的生長因子將PSCs引入相應的胚層——中胚層、內胚層或外胚層。隨后，進一步的生長因子混合物被用來誘導細胞形成分化的類器官。在這里，基質蛋白在類器官形成中起著至關重要的作用，經常被用來模擬基底層。

圖2 | 在當前的細胞模型圖中定位人的類有機體——芯片上的人體等效物（類器官）（10）。

分化的類器官可能由不同類型的細胞組成——上皮細胞和間充質細胞，甚至可能通過內在分化（14）或內皮細胞或中胚層祖細胞的外源性添加獲得初始內皮網絡（15,16）。培養PSC來源類器官的時間因組織類型而異，通常需要2周至3個月（17），但可以持續半年或更長時間，如皮膚類器官（18）或腦類器官（19）。

患者特異性的PSC來源類器官是通過將體細胞重編程為誘導多能干細胞而產生的。然而，這可能需要幾個月的時間。器官類分化的效率在組織類型甚至誘導方案之間差異很大。此外，iPSC衍生的類器官傳代的可能性有限。

由于缺乏可用的組織樣本，從一些組織（如大腦）的ASCs中很難產生類器官。因此，PSC衍生的類器官對于腦類器官的生成是很有價值的。這些類器官已經在3D球形懸浮培養中培養了長達2年以上，且沒有傳代（19,20）。

從ASCs衍生的類器官是從具有再生能力的成人組織中產生的。例如，早期人類牙齒或毛囊發育模型在體外應用間充質凝結原理，分別從供體來源的祖細胞中產生基板或真皮乳頭類器官（21,22）。然而，只有組織的上皮部分才能被生成類器官。基質細胞、內皮細胞和神經在這些模型中缺失。  ASC衍生的類器官的主要好處在于，它們可能來自健康組織或腫瘤組織。類器官形成ASCs通常只需要幾天時間，類器官穩定，可以長期培養和擴張。不同的生長因子組合被用于類器官的擴大和分化，因此，它們可以無限擴大。可以從不同的器官生成來自患者的健康和腫瘤類器官的生物庫，在高通量篩查中測試藥物，以便對患者的治療做出進一步的決策（17）。

在過去的十年中，在學術實驗室中已經使用這些3D培養方法生成了大量種類繁多的人類類器官。它們的應用和潛力已經得到了廣泛的綜述（13,17,23 - 25）。表1強調了在體外靜態培養中產生類器官的人體器官。然而，傳統的靜態培養系統無法最終將類器官分化為成熟的、功能完整的器官模型。類器官在形成過程中出現了局部形態梯度，但缺乏穩定的血液灌流推動的生長因子、氧氣和其他功能性生化或生物物理因素的濃度梯度。因此，靜態培養條件限制了培養時間，因為不斷生長的類器官的營養供應和廢物清除有限性，限制了它們的成熟度。在下文中，我們將討論如何通過引入定義的時空因素來提高類器官的成熟度。

表1 |靜態體外培養產生的人類器官概述

微流控培養系統——早期類器官形成類有機體的關鍵

類器官已被證明是模擬不同器官特異性特的有力工具。然而，如上所述，標記物表達和功能往往在早期就停止了。我們從1912年就知道，體外培養的環境決定了它們的生存能力和功能（100）。驅動類器官自組裝和分化的各向微環境因子在傳統培養條件下相當均勻地覆蓋類器官或廣泛的表面積，阻礙了由功能驅動的空間定向和成熟。但這些源自相互作用的組織并導致細胞重排的時空線索，是發育成熟器官功能的關鍵。但這些源自相互作用的組織并導致細胞重排的時空因子，是成熟器官功能發育的關鍵。特別是內皮組織相互作用及其對器官發生過程中局部信號傳導的影響已被廣泛研究（101-103）。 例如，發育中的中樞神經系統的血管化是大腦發育中至關重要的一步，確保快速分裂的神經前體細胞的氧氣和營養供應。外周神經系統的神經結構已被證明以明顯的與血管同步的方式發展。此外，內皮細胞對于維持產生小腦細胞的中樞神經系統胚層的重要性也得到了證明（104）。

此外，在靜態培養中控制譜系規格的重組蛋白和小分子主要促進器官內某一特定分段細胞(實質細胞)的發育。其他重要的譜系，如血管、神經元或免疫譜系，大多不存在，因此旁分泌信號可能在進一步成熟過程中變得相關。

允許早產兒類器官與其他器官系統在生理相關尺度上精細協調的系統性相互作用，促進功能對齊和更高的空間分辨率的刺激。大自然的器官組建原件——上述形式描述的最小功能單位，在其多樣性中，是一個完整的人體器官。這些重復的亞單位的數量取決于相互作用的器官發出的需求信號。因此，在組織的動態相互作用中，器官的大小、介質流速和液體在器官中的停留時間以及液體與細胞的總體比例會自我調整。

到目前為止，已經設計了幾種使組織模型能夠進行系統性相互作用的方法——患者來源的異種移植(PDX)模型和MPS。在前一種方法中，免疫缺陷或人源化小鼠作為宿主，使主要的腫瘤模型得以移植。移植物與局部和全身環境的相互作用，也通過模型的血管化，最終允許細胞的營養和模型的繁殖。然而，宿主機體和患者組織之間的物種差異阻礙了生物學的匹配。在使用這些方法時已經報到了過多的缺點，但也有支持模型的體循環的數據。

在過去的二十年中，通過將器官模型引入MPS來改善器官模型培養條件已經做出了大量的努力。利用原代和細胞系為基礎的模型已經建立了MPS中的數十種人體類器官，并已進行了非常詳細的綜述（105 - 111）。有充分的證據表明，器官功能的成熟可以通過密切模擬有關生化、物理或電刺激的器官型微環境來實現（106）。

一旦意識到這類系統的自體性質是必要的，MPS領域就開始建立芯片上的干細胞衍生模型。表2總結了該領域的最新成就。此外，為創造缺失器官的類有機體被建立起來只是時間問題。

大量種類繁多的其他人體組織和器官模型已經發表。然而，迄今為止，生物芯片內穩態的培養實驗未能整合全身成分，如通過血管化微血管的全血供應、個性化（自體）免疫系統和組織神經支配。在這里，我們通過將每個相關器官系統的早期類器官整合到一個自我調節的血管化和神經化的體循環中，擴展了創建基于MPS的類有機體的理論。

我們已經在2012年提出假設，“缺乏器官特定細胞類型之間的動態相互作用，以及它們的血管和基質組織床，以及缺乏用于局部再生的成體干細胞和祖細胞，是當前“芯片上的人體"系統的關鍵能力缺失的原因"（5)。整個芯片上微流控通道的血管化早在2013年就報道了（132），接下來是關于生成血管化的芯片上類器官的工作（133-136）。截至今天，產生血管化類器官芯片的高通量平臺已經上市（137）。這兩種技術的結合可以產生包含多個器官的芯片上的封閉血管化通路，從而實現下一個層次的生理復雜性——全血灌注或包含所有相關組成的模型。

生命體理論假設所有關鍵的全血成分——紅細胞、血小板、白細胞和血漿成分——的生成和更新是可行的，并將導致一個自我維持的系統性生命體。因此，一個穩定的功能性芯片上的造血系統是必需的。已經描述了幾種使用MPS來模擬基于人類骨髓的造血干細胞生態位的方法（8,138,139）。調整Sieber等人（138）的模型，使其包含對細胞分化和干細胞維持重要的細胞因子，使來自紅系、髓系和巨核細胞譜系的細胞能夠連續、健壯地生成和維持，同時使干細胞和祖細胞群體維持至少24天（圖3）。簡而言之，骨髓芯片是按照Sieber等人的描述（138）建立的，但通過修改培養基以包括額外的細胞因子，如Chou等人（139)所述。細胞從循環介質中取樣，使用細胞自旋離心機直接沉積在載玻片上，然后使用賴特染色和成像。本研究中所用細胞的供體信息詳見表3。

學術界MPS發展概況提供了許多其他指標，可以使用MPS重現血液灌注的特定因子。Westein等人（140）已經證明了模擬血小板誘導的血液凝固的能力，許多文獻報道了MPS中的免疫細胞循環以及它們在器官模型芯片上的聚集（141-143）。

一旦將基于生物體的生理全血供應給所有芯片上的類器官，使用自體來源的干細胞衍生類器官的資產就變得與防止免疫系統對外來器官模型的排斥有關。此前發表的多器官系統大多由來自不同供體的組織組成，這使得作為任何人體有機體的主要防御機制的個體免疫系統的無排斥整合成為不可能。早在2013年，一個iPSC供體的幾種細胞的自體共培養的第一步就被報道了（144）。iPSC來源的類器官的早熟性提出了這樣一個問題：如何最終分化出這些類器官，使其與各自的人類的功能相匹配。在這里，類有機體理論提出了終端芯片上分化的原則，以整合的有機體交流通訊和人為加速的關鍵器官和系統“訓練計劃"為指導，如肝臟的外生物物質接觸、免疫系統的多抗原接種或性器官加速成熟的類固醇激素人工接觸。2019年，基于生理學的4器官芯片證明了器官-器官相互作用會觸發進一步的芯片上成熟（131），在iPSC衍生的早產兒肝臟模型中，白蛋白和MRP2基因的表達在14天內顯著增加，這是由與iPSC衍生的腸、腎臟和神經類器官的無分化因子共培養驅動的（圖4）。

表2 | 以mps為基礎建立的模型為例，再現了人體關鍵器官的功能

這樣的數據支持了生物樣體理論的概念，即一旦肝臟功能匹配系統生物樣體的需求，就可以通過腸和通過腎臟類器官去除代謝廢物將足以維持生物體的功能內穩態。

人體內大部分血漿蛋白由肝臟產生，其中白蛋白濃度約為40 g/L，血漿是目前為止最大的成分。此外，肝臟是毒物和外來物通過食物到達體內的最終的守門員。最后，它在整個循環過程中保持蛋白質、碳水化合物和氨基酸代謝的穩態。大量MPS文獻提供了證據，證明由原代或iPSC來源的肝細胞組成的芯片上的人類肝臟類器官能夠持續分泌白蛋白和其他蛋白質進入循環（119）。另一個重要的蛋白質成分是白細胞產生的免疫球蛋白G組分，在人的血漿蛋白組分中達到7-16 G /L的生理水平。很少有MPS的目標是在建模免疫組織時產生免疫球蛋白，但一種人工淋巴結在這里已經取得了初步的進展（145）。其他一些器官則向血漿中添加了關鍵的調節蛋白。胰島分泌的胰島素與肝臟相互作用，通過調節葡萄糖的消耗、儲存和釋放來控制身體以葡萄糖為基礎的能量平衡，就是這樣一個關鍵的調節因子。2017年，一種穩定的胰島-肝臟共培養MPS被建立（146），證明MPS有能力從生理上管理胰島素的分泌和器官相互作用能力。關于血漿特性，將芯片上產生的血漿蛋白濃度提高到60-80 g/L的生理水平仍然是一個挑戰，這是一個非常重要的因素，可以利用白蛋白的生理運輸特性，將數百種其他功能蛋白運送到它們的作用位點，并為血細胞運輸提供正確的粘度和流動動力學。

通過內皮細胞將器官模型與血液流動分離是實現這一目標的基本前提，并將在不久的將來為該領域提供進展。 通過在線傳感器密切監測芯片上的代謝活動，通過技術手段對血漿成分進行初步調整，從長遠來看，這可能會導致器官模型的提前成熟。在這里，使用自動化系統來保持對芯片培養物的密切觀察將成為一個組成部分（147）。

圖3 | MPS中骨髓細胞維持和分化情況。將人CD34+細胞在人間充質干細胞種子支架上再循環HUMIMIC Chip2培養（A） 17天或（B) 24天，顯示分化為紅系細胞（第17天），然后是中性粒細胞（第24天）系細胞。細胞是（i）嗜堿性常母細胞，（ii）多色常母細胞，（iii）原色常母細胞，（iv）網織紅細胞，（v）帶細胞和（vi）中性粒細胞。比例尺?75µm。

傳感器通常可以在生物體形態理論的實施中發揮關鍵作用，將個人的數據生成擴展到目前任何可用的范圍之外。一方面，傳感器可以是系統固有的。舉例來說，類似于脈搏血氧測定，生物體血液中的氧飽和度可以通過不同血紅蛋白衍生物的不同光學光譜來測量。此外，脈搏血氧測定法還能提供有關血液搏動特性的定性信息（148）。氧飽和度的測量可以使用小型化傳感器進行，也可以使用高光譜成像技術進行空間分辨。氧飽和度的測量提供了關于氧輸送能力、氧分布的重要信息，并結合微粒成像測速分析，提供了納入一個生物體的每個類器官的絕對耗氧率（149）。

圖4 |白蛋白和MDR2基因表達從第0天到第14天在由ipsc來源的早期兒腸、肝臟、腎臟和神經類器官組成的4器官芯片中穩步增加，這些模型整合在基于生理學的共同介質循環中。僅通過腸吸收無分化因子的培養基。采用單因素方差分析+ Tukey’s多重比較檢驗進行統計分析(*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001)。數據顯示為Mean + SD。

另一方面，傳感器可以直接嵌入到MPS中。多傳感器的集成是允許持續在線監測器官特異性反應和動態組織反應的基礎，用于人體健康監測的技術（150）。多傳感器集成平臺對于基于MPS的生物體體的發展尤其重要，在這種生物體中，對各種器官功能的監測需要結合不同的傳感原理。跨上皮電阻測量是非侵入性技術之一，已成功集成到MPS中，以評估內皮或上皮模型的屏障完整性和連接動力學（151）。基于電阻抗譜的方法通過利用擴展的頻域數據克服了傳統的跨上皮電阻測量技術，因此，可以評估不同成熟階段的組織屏障功能（152）。當與多電極陣列相結合時，基于阻抗的技術可以進一步增強，從而在生物體的相關微環境中提供局部感知和電刺激。應用包括通過對收縮活動的直接電刺激再現心肌細胞或運動神經元的神經支配（153），以及從神經元產生替代腦電圖的可能性活動，這代表了帕金森或阿爾茨海默病建模的附加價值。

器官模型的神經支配在其發育、成熟、調控、再生和病理過程中起著至關重要的作用。我們從手術中了解到，消除自主神經元連接可能會導致移植物功能低下和不良的影響（154）。同樣，神經支配在大多數器官和組織中干細胞和/或其生態位調節中的重要性也得到了充分的證明。在器官發生和再生的初始階段，自主神經會影響組織的生長，同樣，也會影響衰老或疾病的發展和進展。到目前為止，將神經支配引入體外模型大多被忽視，這是由于實現正確的引導和將神經元整合到非神經組織模型的復雜性。在過去的十年中，在靜態和MPS類器官培養中，已經采取了第一步來模擬神經模型之間的突觸連接和神經和非神經組織模型之間的神經效應器連接形成。這一領域的一個主要挑戰是軸突生長從神經元到效應組織的定向引導。因此，MPS的發展使干細胞來源的有髓運動神經元能夠組裝和培養（155,156），是實現MPS功能神經支配的重要基礎。理解組織來源的神經營養因子和神經引導因子如何驅動軸突生長并在發育過程中決定其方向將是有幫助的。

干細胞來源的區域化腦類器官已被證明具有相互形成突觸神經的內在能力。多個研究小組已經描述了區域化干細胞來源的皮質類器官和大腦皮層類器官的融合，以模擬GABAergic中間神經元從大腦皮層類器官遷移到谷氨酸興奮性、富含神經元的皮質類器官，在那里它們在功能上整合到局部興奮性回路（157-159）。這種內在能力也可以被用于組裝其他區域化的腦類器官，正如干細胞來源的皮質和丘腦類器官所顯示的那樣（159）。

Roger D. Kamm的團隊已經證明，干細胞來源的運動神經元類器官可以在一個有圖案的芯片平臺上用3D骨骼肌束構建功能性神經肌肉連接（nmj），這增強了組織結構的引導神經支配。在這個設置中，運動神經元被轉導到光敏通道視紫紅質-2，這使得光激活的肌肉收縮顯示了功能性神經肌肉接頭的形成（160）。另一項關于干細胞來源的類腦器官的研究表明，它們可以發育出明顯的軸突束，這些軸突束在功能上被神經支配到嚙齒動物的脊髓外植體中，它們在那里引起協調的肌肉收縮，很容易區別于局部自發收縮，并可以通過電刺激誘發（31）。神經支配對心臟組織的成熟和功能的積極影響在（161）中得到了證明，交感神經元的神經支配增加了原代心肌細胞的自發搏動率。

已經制定了一些方案，忽略軸突生長對相應的非神經組織類器官的復雜影響；允許在一個類器官中同時分化神經組織和非神經組織。這已經在含有功能性神經肌肉接頭和有髓鞘軸突的神經肌肉類器官中實現了，在許旺末端細胞和肌肉部分收縮活動的存在下，收縮活動在乙酰膽堿受體堵塞時停止（162）。前腦和視神經囊泡的結合也實現了這種器官間球體，其中雙側光敏視神經囊泡發育在前腦類器官的表面，并形成電活性的原始感覺回路（62）。

體外組織神經支配領域的下一個重大進展將是建立一個封閉的神經元回路模型，其中感覺器(如視杯類器官)和效應器(如肌纖維)通過皮質模型相互連接，并通過Schwann細胞或少突膠質細胞實現運動神經元軸突的髓鞘化（156,163）。另一種有前景的方法是結合芯片上的血管化和神經支配。在體內，周圍神經沿著血管生長。我們假設，一旦建立了封閉的血管系統，這種神經支配途徑也將成為相關的芯片。(116）展示了血管化和神經連接的優勢，他們證明了血管-神經相互作用導致更像活體的基因表達特征，并增加含有干細胞來源的大腦微血管內皮細胞和運動神經元的MPS中的鈣瞬變。除了（運動）神經元對生理組織神經支配的積極作用，外周神經系統的建模對于神經退行性疾病(如肌性側索硬化癥)領域也有興趣。體外（MPS）模型有可能成為研究化合物對神經肌肉接頭藥理作用的重要基石。這個方向的第一步是最近在Mimetas OrganoPlate上發表的（164），該平臺培養了40個帶有iPSC衍生的運動神經元的微芯片。后者表現出明顯的軸突生長，可以與肌肉組織耦合形成神經肌肉接頭。

關于機體內穩態的另一個關鍵方面是自主神經支配與免疫系統的相互作用。以消化道為例，腸道免疫系統影響局部腸神經系統、交感神經和副交感神經系統的外源性神經元，并最終影響大腦功能，如情緒、認知和心理健康。相反，大腦可以通過腸道膽堿能抗炎通路，通過迷走神經調節腸道的免疫功能（165）。初級淋巴器官(如骨髓)和次級淋巴器官(如脾臟)的神經支配已得到充分研究，神經系統在這些小生境中影響免疫穩態和炎癥的能力已被證明（166）。

在芯片上模擬系統有機體通路的另一個重要方面包括整合相關供體特異性微生物群，以模擬患者與各自代謝物的總體相互作用（167-169）。

看來，神經支配、血管化、淋巴管、微生物群和膽汁產物的腸-肝臟循環模擬是滿足多器官MPS中類器官的簡單物理結合和生物體中真正的組織相互作用和穩態之間的鴻溝先決條件。

后者需要至少10個人類系統（如引言中強調的那樣）的主要類器官的串聯組合，以及它們通過血管系統、神經支配和淋巴管的生物互聯。關于建立包含至少10個技術上可相互連接的器官培養區隔的MPS的兩項早期嘗試已經發表。這些主要的例子包括康奈爾大學舒勒實驗室（Shuler Lab）的13個器官培養系統（170個）和麻省理工學院格里菲斯實驗室的10個器官培養PhysioMimix系統（171）。這兩種系統都已成功地在培養室中使用生物材料運行了7天或更長時間。然而，兩者都缺乏生物血管互連、淋巴管和器官神經支配。

生物體可能會傳遞什么給我們的醫療系統

根據有機體模型理論，有機體模型是活體人體在體外的生物復制品，只是盡可能縮小了規模。它們是由系統創造的整合：生理學上把人體主要器官的功能單位整合成一個有機的、自我維持的模板，反映人體的系統組織干細胞衍生器官等價物在芯片上的快速分化，源于它們之間的相互串擾和生理上的相互依賴。規模的縮小，是由于產生個體的生物體樣體的大量重復的目標。大量這種相同的、微小的、無腦的、無情緒的生理體外有機體的成熟可以在很長一段時間內保持自我維持的功能性健康內穩態。它們容易受到干擾，導致自然或人為地誘發疾病。患病的生物體被假設以精確地模擬各自病人疾病的病理生理學。反過來，這可能使預測性的患者特異性有機體樣研究的表現，以確定的個性化治療患者有關。類似于對患者隊列的臨床研究，然后可以產生統計驗證的預測，其優勢是可以在生理和病理生理條件下比較基因相同的患者有機體樣體重復。由此可以推導出兩種主要的使用場景。一種是與現實世界中個體患者個人治療的前沿改進有關;另一種則有可能在臨床試驗層面改變藥物開發范式，節省大量時間和資本支出。

關于第一種方案，生物體模型可以用于預測地選擇、安排和給藥，根據患者的疾病進展準確地選擇個性化治療或藥物。通過早期發現不成功的治療方案，這可以顯著降低對每個患者的潛在風險。圖5更詳細地總結了將有機體應用于個性化精準醫療的優勢。該圖說明了有機體體方法的概念和原理，以選擇您的個性化疾病應用的精準醫療。作為一個假設的例子，癌癥被選擇為疾病。

你的生命周期可能最終包括危及生命的疾病時期，例如，癌癥生長（上：藍色邊框的箭頭）。從你的健康細胞中建立一個多能干細胞庫。隨后，在幾個月內就會產生大量相同的健康生物體（黃色三角形）。目前有各種治療癌癥的選擇，因此，相關的試驗組被創建，包括安慰劑治療、其他治療組和健康恢復對照組（在黑邊箭頭中）。在這個假設的例子中，在幾周內，CAR-T細胞療法與檢查點抑制劑相結合，會被證明是你最快的治愈方法。因此，這種療法立即得到了成功的應用。

根據生物體形態理論，一個人的干細胞庫可以在健康時創建，也可以在疾病發生時從健康的器官中創建。預防性干細胞庫(例如，從臍帶血中提取)已經在使用中，并將成為未來的選擇，因為這需要時間。接近人類的理論提供了精確的試驗結果，這是動物試驗在患者來源的異種移植模型或人類患者來源的類器官無法實現的。異種移植模型在系統發育上是遙遠的，因此不能提供足夠的腫瘤生長。此外，它們沒有疫背景來對抗癌癥。病人來源的類器官也沒有嵌入到病人的免疫系統中，缺乏與有機體的系統性互動。

對于第二種情況，數十年來，候選藥物進入臨床試驗成為獲批藥物的平均成功率一直低于20%；這種將任何原型轉化為上市產品的低效率，其他任何行業都承受不起。使用實驗動物的候選藥物的臨床前安全性和療效評估程序的預測性差是造成這種低效率的主要原因。其后果是平均13.5年的漫長臨床試驗，以及一種新藥獲得批準所需的累計成本高達25億美元（106）。與此同時，在過去30年里，一場基于生物學的治療策略革命出現了——利用人體自身的工具來對抗疾病。近年來，藥物的生物復雜性不斷擴大，從人工合成的小分子藥物，到人類單克隆抗體蛋白，最后是針對患者的自體細胞療法，極大地增加了患者治愈的機會。然而，這一趨勢同樣顯著地降低了通過應用臨床前的實驗室動物試驗來預測這類療法的安全性和有效性的機會，原因是這類先進治療藥物的人類起源越來越多（172）。此外，在過去的幾年里，沿著這種不斷上升的生物梯度的藥物定價已經成為阻礙所有患者獲得這種療法的社會公平的主要障礙。在這一趨勢開始的時候，一種生物藥物的平均日劑量的價格是小分子藥物的22倍，占幾十美元（173）。然而，類蛋白質生物制劑中單克隆抗體在2017年達到了患者治療過程的年平均價格約為9.6萬美元（174），相當于每天約263美元。如今，先進細胞療法中的創新——高效的自體CAR-T細胞療法——在德國的價格，例如，考慮到“在"結果（175）付款，患者治療的價格高達32萬歐元。這種療法是一天輸注一次。藥物的療效與患者獲得藥物的經濟能力之間日益增長的失衡，已經成為全球范圍內我們的醫療保健系統的一個嚴重的社會和經濟沖突。

有機體有可能通過改變藥物開發的模式來打破這種成本螺旋上升。2016年，MPS相關報告已經預計，一旦基于MPS的類似于生物體的臨床試驗研究能夠準確預測任何新藥物或療法的療效、安全性、劑量和時間安排，在用于人類試驗和替代動物試驗以及1、2期臨床試驗之前，累積藥物開發成本將降低5倍，藥物開發時間將減少一半。

2018年，毒理學研究領導人論壇（10）草擬了一份高級路線圖，以確定“臨床試驗"預測精度（圖6），在與臨床試驗相對應的芯片研究中運行精細的個性化的“人體"等效物（有機體）。為了實現這一點，套健康的和代表患者疾病狀態和健康內穩態的有機體樣體將允許一個人進行基于臨床前系列藥物和先進的有機體樣體測試。

圖5 |說明有機體理論如何應用于個性化醫療的假設例子。

圖6 |在芯片上潛在的“臨床試驗"背景下的“人體"等效物（10）。 

圖7 |一個假設的例子，說明有機體理論如何可以用來模擬臨床試驗。

健康的內穩態將允許一個人在大型試驗特定患者中模擬臨床試驗的環境中進行基于有機體的藥物和先進療法的臨床前系列試驗。與患者隊列試驗相比，以有機體為基礎的試驗具有許多關鍵的優勢。圖7詳細說明了這些優勢，并舉例說明了利用基于有機體的試驗模擬一種假想的新型鈉-葡萄糖轉運體2（SGLT2）抑制劑治療2型糖尿病的臨床試驗。

根據與臨床試驗招募相同的標準，從全球干細胞庫中收集代表相關糖尿病患者隊列的4名捐贈者的干細胞樣本。從這4個供體小瓶中每個小瓶生產出相關數量的健康生物樣體。藍色、棕色、黃色和綠色表示每個個體的供體背景。隨后，遵循生物樣體理論的原則，例如通過高糖飲食產生糖尿病生物樣體。為了評估一種新的SGLT2抑制劑治療，進行了3個月的試驗，包括6個組，每個組12個有機體樣體（每個組和供體3個生物重復），并每天口服相應的藥物。對照組包括健康恢復組（1）和患病未經治療的安慰劑組（2），分別提供治愈（綠色基線）和疾病狀態無變化（紅色基線）的讀數。此外，三種新的SGLT2抑制劑的劑量降低了10萬倍。由于與人體相比，生物體的大小相對較小，因此患者的劑量比預期的要低。臂（3）、臂（4）和臂（5）的讀數說明了新的單藥療法在分別對應于每天和患者的25 mg（黃色方塊）、15 mg（黃色三角形）和5 mg（黃色圓圈）的劑量下，將疾病狀態從基線改變為治愈的潛力。假設使用二甲雙胍（藍色圓圈）治療的標準單藥治療組提供了當前標準的護理參考數據。在這個假設的例子中，臂（2）產生了最有利的治療結果。

優勢是，在藥物開發歷史，基于芯片的有機體試驗將包括患者身體和同一個體健康身體狀態的統計相關的人體自體生物重復。由于缺乏對單個患者的任何生物重復，以及對他們在健康內穩態下的個體生物狀態的了解，臨床試驗傳統上需要大量的患者隊列。因此，試驗被分為1、2和3期，不幸的是，只能近似一個患者個體的病理生物學和他們的治愈恢復狀態。這兩個方面使得傳統的臨床試驗過程成為一種漫長的、成本高得令人難以置信的、低效的藥物和先進療法的開發方式。在含有健康和患病生物體的芯片上進行“臨床試驗"，消除了這兩個障礙。一方面，它們允許近親繁殖的實驗室動物試驗的一致性由于基因而得到匹配，每個試驗“參與者"在個體有機體水平上的身份，但其背景是人類。另一方面，各種不同個體的生物樣體的使用反映了臨床試驗中患者隊列的異質性，但具有每個個體患者的生物樣體在統計上相關的生物重復的優勢。

有機體體方法的另一個明顯優勢是，在進行此類試驗時，其獨立性不受患者招募和醫院使用的影響。鑒于大型PSC庫的存在反映了基因傾向、性別和與試驗相關的其他類別，基于有機體模型的試驗可以在世界任何時間、任何地點進行。關于上面的假設例子，根據糖尿病易感性選擇供體，比較遺傳祖先和平等的性別分布可能是有趣的干細胞瓶選擇策略。

第三個優點是試驗規模的靈活性。理論上可以產生的患病生物體（通常被稱為芯片上的“病人"）的數量是無限的。這使得藥代動力學方面的整合，在同一個基于有機體的試驗中發現新的化學或生物實體的有效劑量和綜合安全性和有效性評估成為可能。目前在實驗室動物、健康志愿者和患者的單獨臨床前和臨床試驗中產生的數據，如毒性特征、未觀察到的副作用水平、吸收和排泄率、代謝物形成、發現有效劑量、持續時間和新藥物的時間安排，可以從一項基于生物體的試驗中得到。例如，我們治療2型糖尿病的假設案例研究可以很容易地擴展到更大的劑量范圍，并將每天兩次劑量的單一口服（這在生物樣體中指的是根尖腸的任何給藥）進行比較。這將包括對療效進行劑量依賴的評估，同時觀察尿路或生殖道感染的發生和嚴重程度，以及的SGLT2抑制劑的副作用。在各自的患者隊列中，候選藥物使用的治療窗口的定義來源于這樣一項一體化試驗，該試驗仍處于臨床前候選藥物開發階段。

關于這兩種使用場景，我們設想有機體將對從個人數據庫收集的醫療現實世界大數據做出重大貢獻。這是因為它能夠在每個患者第一次疾病發作（例如，腫瘤生長、病毒復制）的確定位置生成關于微環境破壞的可復制數據。有機體和硅芯片的結合將進一步提高對大量患者群體進行精確藥物治療的預測能力，并進一步降低成本。

在人們的心目中，復雜的體外細胞培養工作通常與高昂的成本聯系在一起。有人可能會猜測，在試驗中產生和處理數千個生物體需要天文數字的預算，因為目前可用的MPS在一次性芯片和操作上都很昂貴。在這里，有機體的性質反映了一種自我可持續的人體和規模經濟效應開始發揮作用。在現實世界中，一個處于休息狀態的人體，每天的蛋白質、碳水化合物和脂肪供應約2000千卡就可以維持。在世界上一些較貧窮的地區，人均幾美元就可以實現這一目標。因此，每天喂養10萬只生物體的成本也可以達到相同的水平。維持這些生物體的可消耗芯片的價格也預計將下降到1美元的范圍，這在計算機芯片和人類基因組測序成本方面已經有過先例。

生物機體能夠為每一位患者確定最合適的藥物，并大幅節約成本和改變藥物開發，這種能力的社會經濟維度被認為是巨大的。這同樣適用于倫理層面。基于MPS的類有機體有可能取代大多數實驗室動物試驗和在人類志愿者身上進行的第一和第二階段臨床試驗。它們將減少三期臨床試驗患者的多種數量。所有這些都將對全球范圍內的患者利益和動物福利產生根本性的積極影響。

患者類有機體體和芯片上病人特異性T細胞療法——一個挑戰這一理論的方案

先進的細胞療法，如自體嵌合抗原受體（CAR） T細胞療法KymriahTM 和YescartaTM，最近已經證明了它們治愈以前的耐藥腫瘤患者的潛力（176,177）。除了這兩種在2017年被批準用于治療血液腫瘤的CART細胞產品外，其他幾種CAR-T細胞產品最近也被批準。許多新的細胞治療方法正在醞釀中，使用CAR或轉基因T細胞受體對抗各種各樣的腫瘤、感染和自侵略性免疫細胞，或者使用調節性T細胞在顯性的不良免疫反應中恢復免疫平衡（178）。到2020年底，全球注冊了超過1000項使用免疫細胞產品的臨床試驗（179）。

在這些醫療需求未得到滿足的領域，這種療效以標準安全測試程序（180）為代價，增加了監管機構的接受度，該程序需要在治療批準后的患者隨訪研究中進行回顧性研究。這符合這樣一個事實，即由于患者與患者的系統發育距離、各自的基因型差異和免疫不匹配，患者對個性化細胞治療的反應無法在臨床前的實驗室動物模型中模擬。同樣，在傳統的患者來源的類器官培養中，患者的反應也無法預測，因為它們沒有融入到一個系統的有機體安排中。除其他外，模擬t細胞輸注到目標部位的靜脈輸送及其與其他主要器官部位的相互作用，都缺失了模擬T細胞療法及其療效（患者衍生類器官的精確度）的關鍵因素。 如前所述，這里的有機體理論提供了一種克服任何其他障礙的替代解決方案。

什么是有機體不能也不應該做的

根據有機體理論，有機體不能也不應該模仿人類個體社會起源的主要部分——同理心或意識（分別是靈魂或思想）。因此，它不能模擬病人的精神疾病。300g的人類心肌或髖部骨折的功能障礙及其愈合依賴于生物物理特性，由于規模和所涉及的物理不匹配，其中一些無法在生物類體上表征。

倫理考量對人類社會至關重要，也是人性的基礎。有機體理論，由于其性質，引入了一些必須考慮倫理的觀點。將人類胚胎發育到幾厘米大小是最關鍵的問題之一。在人工環境下（如體外培養），人類卵子的受精及其隨后的胚胎發育在世界上許多地方都是被禁止的。生物體理論的作者想要強調的是，他們的倫理范式超越了這一點。人們不應該使用有機體形態理論的概念和原則來創造人類或雜交胚胎，并進一步發展和區分人類或雜交組織。應該使用其他方法來規避個體發生的這一部分。個人同意捐獻組織來創造生物體可能是一個很好的工具，以防止在早期階段的濫用。

結論

這里提出的生物體樣體理論聲稱，有能力在體外人工重現個體身體的個體發生，從捐贈者的干細胞開始，產生一定數量的相同的健康成熟的小型化身體等量物，因此被稱為生物體樣體。該理論進一步聲稱，這種供體特定的相同生物體樣體反映了該個體健康成年期的某個階段，可以用來模擬該供體在其生命周期的某一特定時間內相關的疾病和康復階段。以個性化的患病生物體樣方法對個體的疾病進行建模，將提供一個尚未滿足的患者病理生物學的現實水平，因此，提供一個的工具，以精確選擇正確的藥物、治療計劃和劑量來治愈（患病）個體。

大自然的遺傳和微環境原則編碼了人體器官最小功能單元的自組織和維護，并將它們整合到一個交流通訊和高效互動的血液系統中，灌注和神經器官是在芯片上創造生物體的藍圖。我們設想它們將成為下一個層次的人類生物學模擬，提供與人類相對應的最佳可能的近似。在體外實驗中，類有機體organismoids將有機地遵循人類的多個類器官串聯，近年來，這已被證明能夠在小型化的規模上模擬單個組織和器官的不同功能。利用已從類器官學習到的東西，類器官將通過一個小型化的基于生理的血管和毛細血管網絡在芯片上生成的全血的系統神經支配和供應，以每個器官的功能單元。通過內皮細胞層將每個類器官從共同的血液中局部分離，將使不同人體器官功能單元的精確拷貝在芯片上實現單獨的器官特異性、遺傳編碼和微環境驅動的自我組裝。反過來，這將使成熟的類器官在生理上產生交流，從而導致有機芯片上的內穩態。一旦建立，生物體將只需要每天用消化的食物等量進食，就可以模擬芯片上的長期、所謂的自我維持的身體功能。

我們已經說明，類器官體外培養技術和過去10年生產的單器官芯片為體外類器官的培養提供了大量數據。此外，人類iPSC衍生的多器官串聯芯片提供了芯片上加速人工器官個體發生的第一個成果。最后，越來越多的關于人類疾病建模和人體組織芯片治療測試的科學文獻指出，當MPS上功能性地建立多器官串聯芯片以及人體芯片時，這種微生理平臺就有能力精確模擬疾病的病理生物學和藥物或治療的作用模式。進一步發展器官芯片的主要挑戰是神經支配和類器官毛細血管化的實現，這也需要細胞，特別是免疫細胞遷移到組織中。

類器官串聯芯片培養系統--- HUMIMIC

多器官串聯培養，在沒病人的情況下測試病人

類器官串聯芯片培養系統包括控制單元和芯片，控制單元能夠模擬人體內生理環境，包括溫度、壓力、真空度、微流道循環頻率、時間等參數，芯片有不同的微流道設計，針對不同的器官可以單獨設置提供相應的培養條件，提供精準的培養和分化環境。類器官串聯芯片培養系統可提供不同類器官的串聯共培養方案，避免單一類器官無法模擬人體復雜生理學條件下器官相互通訊交流的不足。通過類器官模擬人類器官組織的生理發育過程，應用于疾病模型、腫瘤發生、以及藥物安全性、有效性、毒性、ADME等方面的評估，旨在減少和取代實驗室動物測試，簡化人體臨床試驗。

為獲取更高相關與準確的測試結果，我們開發了人體器官模型的自動芯片測試：

配備具有指示相關性的器官模型的芯片，以能夠在接觸生物體之前檢測其安全性和有效性；

最終為芯片配備患者自身相關病變器官的亞基，以評估整個個性化治療的效果；

人體生理反應往往涉及更多介質循環和不同組織間相互作用，多器官芯片才能全面反映出機體器官功能的復雜性、完整性以及功能變化，一個相互作用的系統才能更好的模擬整個系統中器官和組織的不同功能。德國TissUse公司可提供不同類器官的串聯培養解決方案，避免單一類器官無法模擬人體復雜生理學條件下器官相互通訊交流的不足。把多種不同器官和組織培養在芯片上，然后通過微通道連接起來，集成一個相互作用的系統，從而模擬人體中的不同功能器官的交流通訊和互相作用。

TissUse專有的商用MOC技術支持的器官培養物的數量范圍從單個器官培養到支持復雜器官相互作用研究的器官數量，包括單器官、二器官、三器官和四器官培養的商業化的平臺。成功的案例包括：肝臟、腸、皮膚、血管系統、神經組織、心臟組織、軟骨、胰腺、腎臟、毛囊、肺組織、脂肪組織、腫瘤模型和骨髓以及各自的多器官串聯組合方案。

德國TissUse公司專注于類器官培養系統研究22年，推出的HUMIMIC類器官串聯芯片培養系統，得到FDA的推薦，可提供不同類器官的串聯培養解決方案，避免單一類器官培養無法模擬人體器官相互通訊關聯的缺陷，同時也提供相關的技術方案和后續方法試劑支持，屬于國際上少有的“Multi-Organ-Chip" 和“Human-on-a-chip"的方案提供者。相關方案已被廣泛應用于藥物開發、化妝品、食品與營養和消費產品等多個領域.

參考文獻

1. Marx, U.; Walles, H.; Hoffmann, S.; Lindner, G.; Horland, R.; Sonntag, F.; Klotzbach, U.; Sakharov, D.; Tonevitsky, A.; Lauster, R. ‘Human-on-a-chip’ Developments: A Translational Cutting-edge Alternative to Systemic Safety Assessment and Efficiency Evaluation of Substances in Laboratory Animals and Man? Atla-Altern. Lab. Anim. 2012, 40, 235–257. [CrossRef] [PubMed]

2. Almeida, A.; Sarmento, B.; Rodrigues, F. Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients. Int. J. Pharmaceut. 2017, 519, 178–185. [CrossRef] [PubMed]

3. Mehling, A.; Eriksson, T.; Eltze, T.; Kolle, S.; Ramirez, T.; Teubner, W.; van Ravenzwaay, B.; Landsiedel, R. Non-animal test methods for predicting skin sensitization potentials. Arch. Toxicol. 2012, 86, 1273–1295. [CrossRef] [PubMed]

4. Petrova, A.; Capalbo, A.; Jacquet, L.; Hazelwood-Smith, S.; Dafou, D.; Hobbs, C.; Arno, M.; Farcomeni, A.; Devito, L.; Badraiq, H.; et al. Induced Pluripotent Stem Cell Differentiation and Three-Dimensional Tissue Formation Attenuate Clonal Epigenetic Differences in Trichohyalin. Stem. Cells Dev. 2016, 25, 1366–1375. [CrossRef]

5. Mertsching, H.; Weimer, M.; Kersen, S.; Brunner, H. Human skin equivalent as an alternative to animal testing. GMS Hyg. Infect. Contr. 2008, 3, Doc11.

6. Maruguchi, T.; Maruguchi, Y.; Suzuki, S.; Matsuda, K.; Toda, K.I.; Isshiki, N. A New Skin Equivalent—Keratinocytes Proliferated and Differentiated on Collagen Sponge Containing Fibroblasts. Plast. Reconstr. Surg. 1994, 93, 537–544. [CrossRef]

7. Stark, H.J.; Baur, M.; Breitkreutz, D.; Mirancea, N.; Fusenig, N.E. Organotypic keratinocyte cocultures in defined medium with regular epidermal morphogenesis and differentiation. J. Investig. Dermatol. 1999, 112, 681–691. [CrossRef]

8. Reijnders, C.M.A.; van Lier, A.; Roffel, S.; Kramer, D.; Scheper, R.J.; Gibbs, S. Development of a Full-Thickness Human Skin Equivalent In Vitro Model Derived from TERT-Immortalized Keratinocytes and Fibroblasts. Tissue Eng. Part A 2015, 21, 2448–2459.