肝-腎類器官串聯(lián)共培養(yǎng)進(jìn)行藥物測(cè)試

Repeated dose multi-drug testing using a microfluidic chip-based coculture of human liver and kidney proximal tubules equivalents

翻譯整理：北京佰司特科技有限責(zé)任公司

多器官微流控串聯(lián)芯片可模擬組織類器官培養(yǎng)的微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)類器官之間的串聯(lián)培養(yǎng)并減少物種間的差異，所以該技術(shù)成為一種前景廣闊的臨床前藥物篩選的強(qiáng)大工具。中國(guó)食品藥品檢定研究院，安全評(píng)價(jià)研究所（國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心），首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、北京市藥品檢驗(yàn)研究院、德國(guó)柏林工業(yè)大學(xué)聯(lián)合德國(guó)TissUse GmbH公司的科學(xué)家一起合作，建立了一個(gè)基于微流控芯片的類器官模型，可以串聯(lián)肝臟和腎臟類器官，共同培養(yǎng)16天。同時(shí)，對(duì)單獨(dú)給藥環(huán)孢素A（CsA））或聯(lián)合利福平給藥，進(jìn)行了為期14天的重復(fù)劑量的全身給藥。比較兩種不同劑量的CsA對(duì)不同靶器官的毒性特征，與連續(xù)14天使用csA治療相比，從第6天開(kāi)始聯(lián)合利福平用藥會(huì)降低CsA濃度并減輕毒性。肝臟和腎臟類器官在類器官芯片上的串聯(lián)共培養(yǎng)，顯示了其作為藥物開(kāi)發(fā)臨床前階段重復(fù)劑量多種藥物毒性篩選的有效轉(zhuǎn)化工具的潛力。

藥物引起的腎毒性和肝毒性與嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡率有關(guān)。腎臟在維持電解質(zhì)平衡以及處理過(guò)濾、分泌和重吸收方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腎近曲小管通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸（重吸收或分泌）清除外源性物質(zhì)，這得益于表達(dá)功能性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的近端小管上皮細(xì)胞的強(qiáng)極化。肝臟控制著外源性物質(zhì)的代謝，而腎臟則負(fù)責(zé)將其排出體外。外源性物質(zhì)的血漿濃度和生物利用度會(huì)通過(guò)肝臟的毒性/解毒作用發(fā)生改變，從而導(dǎo)致腎臟毒性的改變。因此。腎近曲小管和肝臟是毒性化合物的主要靶點(diǎn)。目前用于證明藥物腎毒性和肝毒性的臨床前模型包括體外和體內(nèi)模型。然而，動(dòng)物模型由于培育時(shí)間長(zhǎng)和動(dòng)物倫理問(wèn)題存在局限性，在靜態(tài)條件下的傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)方法無(wú)法模擬類似體內(nèi)的微環(huán)境。

為了支持ToxCast/Tox21計(jì)劃，需要發(fā)掘更多的高通量毒性評(píng)估預(yù)測(cè)方法。人體器官芯片技術(shù)的發(fā)展克服了當(dāng)前臨床前模型的缺陷，并支持3R原則（即替代、減少和優(yōu)化動(dòng)物使用）。目前的類器官串聯(lián)芯片集成了微流泵和類器官培養(yǎng)部分，使得液體與組織的比例與人體中的相似。肝-腎串聯(lián)芯片滿足體系中營(yíng)養(yǎng)物、化合物及類器官代謝物的分布和交換，因此兩種類器官之間的交流通訊得以保證。

圖1、微流控肝腎二器官串聯(lián)芯片。（A）裝置的放大圖，包括容納兩個(gè)微流道的PDMS芯片。（B）紅色粗體箭頭表示微流道內(nèi)的液體流動(dòng)方向，以及在MOC中共同培養(yǎng)肝臟、腎臟類器官的實(shí)驗(yàn)設(shè)置。（C）16天共培養(yǎng)的示意圖，包括2天的適應(yīng)期和14天的重復(fù)給藥，每天交換培養(yǎng)基，第1、7和14天收集上清，第0和14天收集細(xì)胞樣本。

平衡穩(wěn)態(tài)確保可以觀察到肝臟和/或腎臟損傷的不同階段。此外，人類腎近端小管細(xì)胞可以形成一個(gè)完整的屏障，并表達(dá)對(duì)藥物誘導(dǎo)的腎損傷和藥物相互作用至關(guān)重要的功能性酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。共培養(yǎng)的肝臟類器官表達(dá)了肝特異性標(biāo)記、人類酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其水平與2D細(xì)胞培養(yǎng)相當(dāng)甚至更高，并至少維持了28天。

環(huán)孢素A（CsA）是一種具有腎、肝毒性作用的免疫抑制劑，被用作模型藥物來(lái)刺激基于芯片的肝腎共培養(yǎng)系統(tǒng)。為了進(jìn)一步評(píng)估二聯(lián)器官芯片（2-OC）上的藥物代謝和毒性，我們使用了CsA和利福平（RFP，一種肝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體誘導(dǎo)劑）的聯(lián)合給藥。關(guān)于CsA的藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和毒性的研究結(jié)果表明，不同物種之間存在很大差異，尤其是在代謝特征方面。因此，根據(jù)臨床試驗(yàn)中使用的劑量，將兩種不同的CsA劑量（無(wú)毒/有毒劑量）和RFP治療劑量應(yīng)用于二連器官串聯(lián)芯片。

據(jù)我們所知，這是SHOUCI有研究表明基于微流控芯片的肝-腎類器官串聯(lián)共培養(yǎng)模型可用于連續(xù)14天重復(fù)單獨(dú)或聯(lián)合給藥的毒性研究。肝-腎類器官芯片可有效模擬藥物在人體內(nèi)的相互作用過(guò)程及其對(duì)毒性的影響。研究結(jié)果表明，肝-腎類器官串聯(lián)共培養(yǎng)芯片有望結(jié)合形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)、分子生物學(xué)、藥物代謝和無(wú)創(chuàng)毒性生物標(biāo)志物的檢測(cè)，闡明藥物相互作用、代謝和毒性。

結(jié)果

我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)可容納兩個(gè)相同微流路的二聯(lián)器官芯片，每個(gè)回路將腎近端小管屏障與臟類器官串聯(lián)，用于后續(xù)的共培養(yǎng)。（圖1 A / B ）。

腎近曲小管屏障的特征、完整性和功能：RPTEC/TERT1細(xì)胞在transwell上貼壁培養(yǎng)，分化并形成了完整的單細(xì)胞層（圖2A）。免疫熒光染色結(jié)果表明RPTEC/TERT1細(xì)胞清晰地顯示了泛上皮標(biāo)記物CK8/18（圖2B，C）。通過(guò)對(duì)乙酰化微管蛋白的染色觀察到了初級(jí)纖毛的形成（圖2D）。圖2E和圖2F分別顯示了MRP-2和Na+-K+-ATPase的定位，這些是功能性極化單層RPTEC的指標(biāo)。ZO-1（圖2G）和Claudin-10（圖2H）在細(xì)胞邊界的表達(dá)證實(shí)了鄰近RPTEC/TERT1細(xì)胞之間形成了緊密連接，并表明了適當(dāng)?shù)募?xì)胞極化以及屏障的完整性。Ki67的陽(yáng)性染色（圖2I）顯示了增殖的細(xì)胞。

在圖2J-L中展示了在2-OCs中16天培養(yǎng)期間，功能性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP-2、P-gp和Ki67的RT-qPCR分析結(jié)果，用作基因表達(dá)變化的對(duì)照。

圖2、腎近端小管屏障的特征。 （A） Transwell上形成腎近端小管單層細(xì)胞。 （B） CK8/18（綠色） （C） CK8/18（綠色），橫截面 （D） 乙酰化微管蛋白（綠色） （E） MRP-2（紅色） （F） 鈉鉀ATP酶（紅色） （G） ZO-1（紅色） （H） Claudin-10（紅色） （I） Ki67（紅色）。 細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）染色。 比例尺：B、D和E：100μm；C、F、G、H和I：50μm。 對(duì)（J） MRP-2 （K） P-gp （L） Ki67的基因表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR分析。數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三次重復(fù)。

肝的特征和功能：HepaRG細(xì)胞的形態(tài)和分化、肝球的形成、免疫熒光染色以及肝臟功能酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的RT-PCR分析見(jiàn)附錄。圖1.結(jié)果表明，微流控多器官串聯(lián)芯片中的肝球體具有長(zhǎng)期維持和可重復(fù)分化的特點(diǎn)，細(xì)胞增殖、分化和凋亡之間達(dá)到了平衡，從而實(shí)現(xiàn)了肝球體的生理平衡。

二器官串聯(lián)芯片培養(yǎng)16天的表現(xiàn)：腎臟類器官（代表排泄系統(tǒng)）和微流道通路（代替血液循環(huán)）中的LDH水平的檢測(cè)結(jié)果表明（圖3A）二器官芯片中的排泄系統(tǒng)和血液循環(huán)中的LDH產(chǎn)生水平保持穩(wěn)定，這表明在整個(gè)16天的共培養(yǎng)過(guò)程中，不同培養(yǎng)腔內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生了人為但穩(wěn)定的生理更替。

在16天的共培養(yǎng)期間，兩種培養(yǎng)基中的葡萄糖水平測(cè)量結(jié)果總結(jié)在圖3B中。微流道通路和培養(yǎng)腔的葡萄糖濃度嚴(yán)格維持在2.5 mM至6mM之間，以確保為二聯(lián)器官芯片提供足夠的能量。近端小管腔內(nèi)的葡萄糖水平比初始培養(yǎng)基中的17.5 mM降低了大約三倍。微流道循環(huán)中的葡萄糖濃度持續(xù)下降到初始11.1 mM的50%，這在正常血糖的范圍內(nèi)。這些發(fā)現(xiàn)表明，在16天的肝-腎串聯(lián)共培養(yǎng)期間，二聯(lián)器官芯片建立了一個(gè)非常穩(wěn)定的葡萄糖平衡。

圖3、16天內(nèi)肝腎類器官共培養(yǎng)系統(tǒng)的表現(xiàn)。（A）2-OC系統(tǒng)中的系統(tǒng)組織活力由微流道通路（紅色）和近端小管腔（黃色）乳酸脫氫酶（LDH）產(chǎn)量表示。（B）2-OC中的流道通路（紅色）和近端小管腔內(nèi)（黃色）的葡萄糖濃度平衡。虛線代表每天加入肝臟部位（紅色）和近端小管腔內(nèi)（黃色）的培養(yǎng)基的初始葡萄糖濃度。（C）通過(guò)測(cè)量循環(huán)培養(yǎng)基中的乳酸產(chǎn)量和葡萄糖消耗來(lái)衡量共培養(yǎng)的代謝活性。

我們利用微流道通路中的葡萄糖消耗量和乳酸生成量，作為評(píng)價(jià)共培養(yǎng)系統(tǒng)代謝活動(dòng)的指標(biāo)（圖3C）。2-OC系統(tǒng)的新陳代謝活動(dòng)呈現(xiàn)雙相曲線，在前兩天未給藥的情況下，新陳代謝活動(dòng)持續(xù)下降，而從第零天開(kāi)始，新陳代謝活動(dòng)進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)，略有波動(dòng)。微流道通路中乳酸生成量的輕微下降可能表明肝球和近端小管屏障之間存在條件效應(yīng)。

細(xì)胞活力和代謝曲線都證明，2-OC系統(tǒng)可以同時(shí)、連續(xù)培養(yǎng)肝、腎類器官16天，同時(shí)保持其活力和特征功能。以重復(fù)性高，穩(wěn)定性強(qiáng)的方式建立微流控連接的串聯(lián)共培養(yǎng)系統(tǒng)有利于在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用這些物質(zhì)。

基于芯片的肝-腎類器官串聯(lián)培養(yǎng)系統(tǒng)十四天重復(fù)劑量藥物暴露模型：用CsA或CsA結(jié)合RFP處理基于芯片的肝-腎串聯(lián)共培養(yǎng)模型，以觀察在不同程度的毒性威脅下器官之間的相互作用。在給藥第一天（第1天）和最后一天（第14天）以及聯(lián)合給藥第一天（第7天）之后的24小時(shí)，取樣檢測(cè)肝類器官代謝后的CsA（圖4A）或RFP（圖4B）濃度。如圖4C所示，在第1天、第7天和第14天給藥后24小時(shí)，隨著劑量水平從5uM增加到20 uM肝類器官在微流道通路的CsA暴露增加。連續(xù)給藥七天后24小時(shí)的CsA水平低于第一次和最后一次給藥后的水平。在第一次和最后一次聯(lián)合給藥后，當(dāng)20 uMCsA與25uM RFP全身聯(lián)合給藥時(shí)，微流道通路中的CsA濃度下降。同時(shí)給藥RFP8天后，有RFP或無(wú)RFP循環(huán)之間CsA濃度的降低有所減弱。同時(shí)，每天聯(lián)合給藥8天后，RFP的濃度增加（圖4D），表明RFP在微流道通路積累。為了評(píng)估毒性物質(zhì)對(duì)肝、腎類器官的影響，我們檢查了乳酸脫氫酶（LDH）的釋放。LDH作為評(píng)估體外腎毒性的可靠生物標(biāo)志物，我們?cè)趦煞N培養(yǎng)基中進(jìn)行了測(cè)定。在第1天、第7天和第14天，隨著環(huán)孢素A（CsA）濃度的增加，微流道通路中的LDH濃度逐漸增加（圖 5A）。連續(xù)8天聯(lián)合給藥25uM RFP后，全身給藥20uM CsA的血路中LDH水平下降，這與微流道通路中的CsA濃度一致。然而，SHOU CI 聯(lián)合給藥后未觀察到這種下降（圖5A）。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，聯(lián)合給藥組的p53基因表達(dá)比未處理的對(duì)照組增加了1.5倍，而Ki67的表達(dá)沒(méi)有變化（圖5B，C）。然而，排泄腔中的LDH釋放量顯示出急劇但不顯著的增加（圖5H）。SHOU CI 聯(lián)合給藥后，與未處理的對(duì)照組相比，第7天的IDH水平繼續(xù)升高（圖5H）。然而，在同時(shí)使用RFP8天后，可以觀察到LDH水平急劇下降（圖5H）。此外，與對(duì)照細(xì)胞相比，用高劑量CsA處理14天的腎類器官中p53基因的表達(dá)量增加了2.3倍（圖5I，J）。同時(shí)用CsA和RFP處理的腎類器官中，Ki67基因的表達(dá)量增加了2.7倍，而在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，低劑量組和高劑量組的Ki67表達(dá)量都顯著下降（圖5I，J）。如圖5D-G所示，TUNEL/Ki67/DAPT三重染色顯示CsA暴露增加了細(xì)胞死亡，而在CsA與RFP聯(lián)用的肝海綿體中可以觀察到細(xì)胞死亡的緩解。通過(guò) Ki67陽(yáng)性染色觀察到的增殖細(xì)胞均勻地分布在肝球中，并保持在芯片中，不同處理組之間沒(méi)有顯著變化（圖5D-G）。

常規(guī)和新型非侵入性毒性生物標(biāo)志物的蛋白質(zhì)表達(dá)：為了探索MOC平臺(tái)在早期檢測(cè)和診斷器官特異性毒性方面的進(jìn)一步應(yīng)用，我們檢測(cè)了已被批準(zhǔn)用于臨床實(shí)踐的常規(guī)和新型生物標(biāo)志物，以確定本實(shí)驗(yàn)中的藥物誘導(dǎo)的肝臟和腎臟損傷。生物標(biāo)志物水平變化的觀察結(jié)果列于補(bǔ)充表3中。

圖4、每日給藥或聯(lián)合給藥后CsA和RFP的濃度測(cè)定以及2-OC中肝-腎類器官的代謝。（A）循環(huán)介質(zhì)中CsA的質(zhì)譜。箭頭表示CsA的特征峰。（B）循環(huán)培養(yǎng)基中RFP的質(zhì)譜。箭頭表示RFP的特征峰。（C）每天重復(fù)給藥，聯(lián)合給藥后循環(huán)介質(zhì)中CsA的濃度，以及第1、7和14天在2-OC中肝-腎類器官的代謝情況。（D）每天重復(fù)聯(lián)合給藥后循環(huán)介質(zhì)中RFP的濃度，以及第7和14天在2-OC中肝-腎類器官的代謝情況。實(shí)驗(yàn)分別在對(duì)照組和低劑量組進(jìn)行了三次重復(fù)，而在高劑量組和聯(lián)合給藥組進(jìn)行了四次重復(fù)。* （#） 或 **（##） 分別表示 p 值小于0.05 或0.01 的顯著性差異。* 或 # 分別表示與相應(yīng)對(duì)照組或聯(lián)合給藥組與高劑量組比較的差異。

微流道通路中的生物標(biāo)志物（圖6），肝酶AST呈劑量依賴性升高，聯(lián)合用藥組的AST水平在終點(diǎn)而非RFPSHOU CI 用藥后出現(xiàn)下降。ALP在CsA治療后升高，僅在第14天有顯著變化，而在20uM CsA給藥時(shí)，同時(shí)使用RFP會(huì)降低ALP水平。只有在RFP后階段才能觀察到TBiI的顯著增加。微流道通路中葡萄糖的下降呈劑量依賴性，這些分子在第7天的高劑量組和第14天的兩個(gè)治療組中都達(dá)到了有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的水平。同時(shí)使用20 uM CsA和RFP治療后，在聯(lián)合給藥階段，代用血回路中的葡萄糖濃度升高。代用血中的腎毒性生物標(biāo)志物CRE和UREA在第1天有所增加，但在第7天和第14天未觀察到與藥物有關(guān)的變化。AB、GGT和Lac的水平未發(fā)現(xiàn)與CsA相關(guān)的變化。

在排泄系統(tǒng)中的生物標(biāo)志物：在排泄介質(zhì)中（見(jiàn)圖7），GGT（γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶）水平在第一天顯示出劑量依賴性增加。然而，在連續(xù)七次CsA治療后，高劑量組的GGT水平明顯下降，第14天也觀察到了類似的效果。與RFP的同時(shí)治療在第7天和第14天并未導(dǎo)致GGT水平降低。所有治療組的近端小管屏障部分也是如此。

圖5、在肝-腎類器官串聯(lián)芯片中每日單獨(dú)或同時(shí)使用CsA14天的毒性概況。（A）第1、7和14天代用血液培養(yǎng)基中的LDH活性。qRT-PCR分析實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)肝臟球體內(nèi)（B）p53（C）Ki6基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，（D）對(duì)照組、（E）低劑量組、（F）高劑量組和（G）聯(lián)合用藥組肝球形細(xì)胞的TUNEL/Ki67（綠色/紅色）染色。（H）第1、7和14天排泄介質(zhì)中的LDH活性。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，近端小管屏障中（I） p53和（J）Ki67基因表達(dá)的qRT-PCR分析。數(shù)據(jù)為平均值主±標(biāo)準(zhǔn)差，實(shí)驗(yàn)分別在對(duì)照組和低劑量組進(jìn)行了三次重復(fù)，而在高劑量組和聯(lián)合給藥組進(jìn)行了四次重復(fù)。* （#） 或 ** （##） 分別表示 p 值小于 0.05 或 0.01 的顯著性差異。* 或 # 分別表示與相應(yīng)對(duì)照組或聯(lián)合給藥組與高劑量組比較的差異。

隨著CsA劑量的增加，尿液中的NAG酶也會(huì)分泌。CsA和RFP對(duì)排泄池中ALP的影響相似。在CsA作用下，葡萄糖呈劑量依賴性下降，聯(lián)合用藥組的葡萄糖水平低于CsA治療組。CsA治療后Lac濃度明顯升高，而RFP減輕了CsA對(duì)Lac分泌的影響。

圖6、在肝-腎串聯(lián)培養(yǎng)芯片中每天單獨(dú)或同時(shí)使用CsA 14天后，微流道通路中無(wú)創(chuàng)毒性生物標(biāo)志物的蛋白質(zhì)表達(dá)。蛋白水平（A）AST（B）ALP（C） TBiL（D）Glucose（E） CRE（F）UREA（G）AIB（H）CGT（I）第1、7和14天循環(huán)介質(zhì)中的乳酸鹽。數(shù)據(jù)為平均值主±標(biāo)準(zhǔn)差，實(shí)驗(yàn)分別在對(duì)照組和低劑量組進(jìn)行了三次重復(fù)，而在高劑量組和聯(lián)合給藥組進(jìn)行了四次重復(fù)。* （#） 或 ** （##） 分別表示 p 值小于 0.05 或 0.01 的顯著性差異。* 或 # 分別表示與相應(yīng)對(duì)照組或聯(lián)合給藥組與高劑量組比較的差異。
   KIM-1是腎臟特異性生物標(biāo)志物，已通過(guò)監(jiān)管機(jī)構(gòu)的正式鑒定，在整個(gè)研究期間呈劑量依賴性升高，CsA介導(dǎo)的KM-1升高隨時(shí)間推移而減弱，同時(shí)服用RFP時(shí)也是如此。排泄介質(zhì)中的CysC和ColIⅣ水平也出現(xiàn)了類似的結(jié)果。但在RFP后階段，RFP會(huì)增強(qiáng)ColIⅣ的作用。CsA治療后，Clu和NGAL的濃度明顯升高，而RFP明顯降低了Clu和NGAL的水平。此外，在研究的中期階段，這兩種生物標(biāo)志物的分泌水平達(dá)到了ZUI 高水平，使用RFP后的降低幅度也最大。在實(shí)驗(yàn)期間，OA的分泌水平是持續(xù)的，高劑量組的OA水平維持在較高水平。聯(lián)合給藥組的OA降低呈延遲顯著性。同樣，用20uM CsA處理后，IP-10有所增加，而RFP則在第14天使IP-10略有下降。CsA誘導(dǎo)的GST-a和白蛋白水平的劑量依賴性增加僅在第1天才能觀察到。CsA增強(qiáng)了FABP-1，而同時(shí)使用RFP產(chǎn)生的降低直到后期（第14天）才被觀察到，而REN和a1-MG在第7天和第14天發(fā)生了類似的藥物誘導(dǎo)變化。在第1天，CsA可引起OPN的增加，但與劑量無(wú)關(guān)，而在第7天，OPN的增加與劑量有關(guān)。雖然CsA對(duì)OPN的影響在第14天消失了，但RFP誘導(dǎo)的OPN明顯降低在RFP后階段得以保持。TIMP-1在第1天顯示出劑量依賴性的顯著增加。然而，CsA對(duì)TIMP-1的影響在第7天和第14天逆轉(zhuǎn)。在RFP后階段，CsA對(duì)TIMP-1水平的增加有不同程度的減弱。使用CsA或同時(shí)使用RFP治療后，EGF會(huì)出現(xiàn)劑量依賴性下降。在CAIB和TFF-3中未觀察到與藥物相關(guān)的變化（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖7、在肝-腎串聯(lián)培養(yǎng)芯片中每天單獨(dú)或同時(shí)使用CsA 14天后，排泄腔中非侵入性毒性生物標(biāo)志物的蛋白質(zhì)表達(dá)。（A）CGT （B） ALP（C）NAG（D）葡萄糖（E）乳酸鹽（F）KIM-1（G）胱抑素C的蛋白質(zhì)水平（H）膠原Ⅳ（I）凝集素（J）NGAL （K）骨活素（L）IP-10（M）GST-a（N）白蛋白（O）FABP-1（P）腎素（Q）α1-微球蛋白（R）骨素（S）TIMP-1（T）第1天、第7天和第8天排泄培養(yǎng)基中的表皮生長(zhǎng)因子14。數(shù)據(jù)為平均值±SEM，實(shí)驗(yàn)分別在對(duì)照組和低劑量組進(jìn)行了三次重復(fù)，而在高劑量組和聯(lián)合給藥組進(jìn)行了四次重復(fù)。* （#） 或 ** （##） 分別表示 p 值小于 0.05 或 0.01 的顯著性差異。* 或 # 分別表示與相應(yīng)對(duì)照組或聯(lián)合給藥組與高劑量組比較的差異。

代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)的變化：在本研究中，我們進(jìn)一步研究了在兩個(gè)類器官中表達(dá)的功能酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體及其在解毒或毒化過(guò)程中的作用（圖8）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，同時(shí)使用RFP會(huì)顯著誘導(dǎo)肝臟、腎臟類器官中MRP-2的表達(dá)。與RFP同時(shí)給藥后，肝球體中Pgp基因的表達(dá)略有增加。相比之下，RPTEC/TERT1細(xì)胞中的P-gp基因表達(dá)可以通過(guò)連續(xù)使用環(huán)孢素A （CsA） 顯著誘導(dǎo)，而在聯(lián)合給藥組中，P-gp基因的誘導(dǎo)則無(wú)法觀察到。

圖8、在肝-腎串聯(lián)共培養(yǎng)芯片中每天單獨(dú)或同時(shí)使用RFP 14天后，代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體在肝球和近端小管屏障中的基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，肝臟（A）MRP-2（C） Pgp （E）CYP3A4 （F）BSEP和腎內(nèi)（B）MRP-2（D）P-gp的mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比的折疊變化。數(shù)據(jù)為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差，實(shí)驗(yàn)分別在對(duì)照組和低劑量組進(jìn)行了三次重復(fù)，而在高劑量組和聯(lián)合給藥組進(jìn)行了四次重復(fù)。* （#） 或 ** （##） 分別表示 p 值小于 0.05 或 0.01 的顯著性差異。* 或 # 分別表示與相應(yīng)對(duì)照組或聯(lián)合給藥組與高劑量組比較的差異。

在CsA處理組中，觀察到CYP3A4和BSEP的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和劑量依賴性的下降。CsA對(duì)BSEP的抑制作用因同時(shí)給予RHP而略有減弱，而CsA組和同時(shí)治療組之間的CYP3A4則無(wú)明顯差異。

討論

最新研究表明，類器官芯片技術(shù)可重建三維（3D）微環(huán)境，模擬人體器官和組織的結(jié)構(gòu)、力學(xué)、生理和代謝特性。例如，利用三維技術(shù)建立的肝類器官模型顯示出增強(qiáng)的肝功能，特別是當(dāng)非實(shí)質(zhì)細(xì)胞被整合進(jìn)類器官時(shí)。我們已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了聚集穩(wěn)定且重復(fù)的肝類器官分化方案，其中包括分化的HepaRG（實(shí)質(zhì)）和HHSteC（非實(shí)質(zhì)）細(xì)胞，并能夠再現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)，即肝臟的功能單位。HepaRG細(xì)胞系被用作體外模型來(lái)預(yù)測(cè)藥物對(duì)人體細(xì)胞色素P450 （P450）酶的誘導(dǎo)作用。此外，模擬圍繞肝類器官的流體剪切應(yīng)力和間質(zhì)壓力有助于在芯片中長(zhǎng)時(shí)間維持基于蛋白質(zhì)和氧梯度的穩(wěn)定微環(huán)境。而且，包括ZO-1和Claudin-10在內(nèi)的相關(guān)蛋白的表達(dá)，表明在整個(gè)共培養(yǎng)過(guò)程中，近曲小管細(xì)胞屏障的緊密連接組裝和細(xì)胞極性得到了保持。

長(zhǎng)期以來(lái)，血清中的肌酐（CRE）和尿素（UREA）的測(cè)量已被用于診斷CsA引起的腎毒性；然而，如本研究所觀察到的，這些生物標(biāo)志物在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不顯示分泌，因此不敏感且不足。人類RPTEC/TERT1細(xì)胞系被證明能夠極化形成緊密的單層，并表達(dá)特定組織的酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白較長(zhǎng)時(shí)間，因此已被建立為藥物安全評(píng)估的體外模型。現(xiàn)有的基于芯片的肝臟-近曲小管共培養(yǎng)模型復(fù)制了兩個(gè)器官和室間的長(zhǎng)期生理和分子通信。芯片中共培養(yǎng)的近曲小管屏障等價(jià)物表達(dá)了若干生物標(biāo)志物，如KIM-1、CLU、OA和NGAL，用于長(zhǎng)時(shí)間的毒性評(píng)估，模擬體內(nèi)對(duì)腎毒性暴露的反應(yīng)。FDA和EMEA已批準(zhǔn)了八種非侵入性腎損傷生物標(biāo)志物，這些標(biāo)志物在體內(nèi)已被充分描述，并且能在動(dòng)物或人類的尿液或血液中檢測(cè)到。在這八種合格的生物標(biāo)志物中，KIM-1、白蛋白、Clu和TFF-3被認(rèn)為是與急性腎小管變性相關(guān)的標(biāo)志物。

與先前研究一致，對(duì)急性CsA誘導(dǎo)的腎毒性有反應(yīng)的其余標(biāo)記物，包括排泄介質(zhì)中的GST-α、NGAL、OPN、GGT、NAG和TIMP-1，以及代用血中的CRE和UREA，可以被分類為腎小管功能損傷的生物標(biāo)志物。研究顯示，與急性腎小管上皮損傷（包括CsA引起的損傷和體內(nèi)小管間質(zhì)纖維化）相關(guān)的OA上調(diào)。OA的劑量依賴性增加支持了將OA分類為早期近曲小管損傷的敏感生物標(biāo)志物的結(jié)論。主要在肝臟產(chǎn)生的尿液α1-MG在小管和腎小球損傷時(shí)都可能升高。肝特異性的FABP（即FABP-1）在近曲小管中表達(dá)。這些分子都是急性和尤其是慢性腎小管損傷的生物標(biāo)志物，因此，這些發(fā)現(xiàn)可以部分解釋治療晚期才觀察到的FABP-1和α1-MG水平升高。整個(gè)研究期間，高劑量CsA上調(diào)了Col IV。此外，Col IV在腎小管基底膜中表達(dá)；因此，共給藥組中Col IV的上調(diào)表明了在第14天Ki67基因表達(dá)誘導(dǎo)下的腎上皮細(xì)胞再生。CALB存在于小腸中，在長(zhǎng)期使用CsA后會(huì)在遠(yuǎn)端腎小管中受到抑制。因此，CALB作為體外和體內(nèi)腎小管損傷的生物標(biāo)志物對(duì)CsA的單次和重復(fù)治療的反應(yīng)與藥物無(wú)關(guān)。這是SHOU CI 報(bào)告在微流控MOC平臺(tái)上評(píng)估一系列合格和潛在的非侵入性腎毒性生物標(biāo)志物，展示了MOC在早期藥物開(kāi)發(fā)中進(jìn)行高通量篩選的能力和優(yōu)勢(shì)。
       腸道屏障和腎小球等價(jià)物將被整合到新型的MOC系統(tǒng)中，例如四器官芯片，以改進(jìn)和優(yōu)化我們的研究。一方面，需要考慮CsA的低生物利用度。CsA的低生物利用度主要是由于肝臟代謝，部分原因是腸道吸收。生物利用度的降低很可能可以通過(guò)腸道CYP450酶的誘導(dǎo)來(lái)解釋，這種誘導(dǎo)顯著大于肝臟代謝的誘導(dǎo)。CsA對(duì)體內(nèi)腸肝循環(huán)的影響將在MOC平臺(tái)上得以模擬。
結(jié)論
       本研究評(píng)估的微流控多器官芯片平臺(tái)使得可以在16天內(nèi)，通過(guò)連接的培養(yǎng)基回路，非接觸共培養(yǎng)可重復(fù)且定義明確的肝球體和腎近曲小管屏障，每種結(jié)構(gòu)比其人體對(duì)應(yīng)器官小100,000倍。此外，微流控設(shè)備和2-OC模型中設(shè)計(jì)的流體與組織比率支持充分的器官間通訊。最后，共培養(yǎng)的組織等價(jià)物表達(dá)了組織特異性的標(biāo)志物、酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并且可以通過(guò)具有肝毒性和腎毒性的CsA進(jìn)行挑戰(zhàn)，這些毒性可以通過(guò)肝臟藥物代謝誘導(dǎo)劑RFP得到緩解。目前基于微流控芯片的平臺(tái)適合標(biāo)準(zhǔn)化的微組織大小和組織培養(yǎng)格式，可廣泛應(yīng)用于藥物篩選，并且越來(lái)越多地被監(jiān)管機(jī)構(gòu)接受。

材料和方法

設(shè)計(jì)和制造二聯(lián)器官芯片：商業(yè)可用的微生理二聯(lián)器官芯片2-OC由兩個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)插件集成。2-OC的制造由TissUse GmbH按照Wagner等人的描述進(jìn)行。電路中的流體流動(dòng)是由根據(jù)Wu等人的修改，在芯片上的脈沖式微型泵建立的。芯片上的微型泵通過(guò)由TissUse GmbH提供的外部控制單元的壓縮空氣來(lái)驅(qū)動(dòng)。

人類細(xì)胞來(lái)源：人類HepaRG細(xì)胞系和人類近曲小管細(xì)胞系RPTEC/TERT1（CRL-4031）均從ATCC（位于美國(guó)弗吉尼亞州曼納薩斯的ATCC）購(gòu)買(mǎi)。HHSteC細(xì)胞系是從ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室（位于美國(guó)加利福尼亞州卡爾斯巴德的ScienCell）購(gòu)買(mǎi)的。

肝臟類器官培養(yǎng)：HepaRG細(xì)胞在HepaRG培養(yǎng)基中培養(yǎng)（含William’s medium E，補(bǔ)充10%胎牛血清（FBS, Life Technologies; 澳大利亞新南威爾士州悉尼），2 mM GlutaMAX，10000 U/ml青霉素，10000 μg/ml鏈霉素，5 µg/ml人胰島素（Sigma-Aldrich, 美國(guó)圣路易斯）和5×10–5 M氫化可的松半琥珀酸鹽（中國(guó)北京的國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局）。細(xì)胞培養(yǎng)基及其補(bǔ)充劑均從Life Technologies（美國(guó)加利福尼亞州卡爾斯巴德）購(gòu)買(mǎi)。HepaRG細(xì)胞培養(yǎng)在37°C和5% CO2條件下，每隔一天更換一次培養(yǎng)基。通過(guò)在HepaRG培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞兩周以誘導(dǎo)HepaRG細(xì)胞分化，達(dá)到貼壁生長(zhǎng)。然后添加含2%二甲基亞砜（DMSO; Sigma-Aldrich; 美國(guó)密蘇里州圣路易斯）的分化培養(yǎng)基再培養(yǎng)兩周。HHSteC細(xì)胞在從ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室（美國(guó)加利福尼亞州卡爾斯巴德的ScienCell）購(gòu)買(mǎi)的星形細(xì)胞培養(yǎng)基中擴(kuò)展。細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)達(dá)到80%時(shí)收獲用于進(jìn)一步共培養(yǎng)。

人類肝球體的形成按照Wagner等人之前的描述進(jìn)行。簡(jiǎn)單地說(shuō)，每個(gè)384孔球體板孔中放置50μl含0.1×104HHSteC細(xì)胞和2.4×104 HepaRG細(xì)胞的細(xì)胞懸液（Corning Costar, 美國(guó)肯納邦克）。細(xì)胞在CO2孵化器中的搖床上培養(yǎng)3天，形成圓形且緊湊的球體。然后將球體轉(zhuǎn)移到超低附著力24孔板（Corning Costar, 美國(guó)肯納邦克）。收集40個(gè)球體形成一個(gè)2-OC系統(tǒng)的單一肝等價(jià)物。在EVOS XL Core數(shù)字倒置顯微鏡（Life Technologies, 美國(guó)加利福尼亞州卡爾斯巴德）下評(píng)估分化的HepaRG細(xì)胞的形態(tài)和肝球體的形成。

腎近曲小管屏障模型建立：RPTEC/TERT1細(xì)胞在添加了2 mM GlutaMAX、10,000 U/ml青霉素、10,000 μg/ml鏈霉素、36 ng/ml氫化可的松、5 μg/ml人胰島素、5 μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、5 ng/mlXI酸鈉（ITS 1×）、10 ng/ml人表皮生長(zhǎng)因子（hEGF）的DMEM和Ham’s F-12 （DMEM/F12）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基和補(bǔ)充劑均從Life Technologies（美國(guó)加利福尼亞州卡爾斯巴德的Life Technologies）購(gòu)買(mǎi)。氫化可的松從Sigma-Aldrich（美國(guó)圣路易斯的Sigma-Aldrich）購(gòu)買(mǎi)。
       每個(gè)Transwell可滲透支架種植100,000個(gè)RPTEC/TERT1細(xì)胞，并允許它們?cè)谝归g附著。然后，更換上室的培養(yǎng)基以移除未附著的細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)前，種植的支架在2-OC中靜態(tài)培養(yǎng)4天，灌流條件下培養(yǎng)3天。在2-OC內(nèi)，將插入膜定位在培養(yǎng)室底部上方100 μm的位置，以確保介質(zhì)在近曲小管屏障下自由通過(guò)。使用EVOS XL Core數(shù)字倒置顯微鏡（Life Technologies, 美國(guó)加利福尼亞州卡爾斯巴德的Life Technologies）監(jiān)測(cè)RPTEC/TERT1的細(xì)胞形態(tài)和分化。

基于芯片的共培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)使用十四個(gè)2-OC系統(tǒng)，共培養(yǎng)在500微升循環(huán)培養(yǎng)基中，屏障插件頂部添加100微升培養(yǎng)基。排泄池中的培養(yǎng)基每天更換。循環(huán)上清的一半被替換并收集。在16天共培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，通過(guò)免疫熒光和qRT-PCR分析肝臟或近曲小管等價(jià)物的器官特異性功能標(biāo)志物。芯片上的微泵設(shè)置頻率為0.8 Hz，從而產(chǎn)生的流速不超過(guò)9微升/分鐘。

實(shí)驗(yàn)試劑：CsA（CAS號(hào)：59865-13-3）被添加到重復(fù)劑量的共培養(yǎng)中進(jìn)行測(cè)試。RFP（CAS號(hào)：13292-46-1）與CsA同時(shí)給藥。對(duì)于儲(chǔ)備液，CsA和RFP（中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局-北京）溶解在DMSO中，在4°C暗處儲(chǔ)存，使用時(shí)稀釋到最終濃度0.1%的DMSO。

藥物暴露于肝臟-腎臟共培養(yǎng)芯片：在三天無(wú)藥物適應(yīng)性共培養(yǎng)后，CsA儲(chǔ)備液被稀釋至相應(yīng)濃度的新鮮培養(yǎng)基中，10 µM（低劑量）和20 µM（高劑量），并每日給藥13天。在聯(lián)合給藥組中，每天給予20 µM CsA，直到第6天，然后從第6天到第13天每天同時(shí)給予20 µM CsA和25 µM RFP。含0.1% DMSO的培養(yǎng)基用于對(duì)照培養(yǎng)（見(jiàn)圖1C）。

共培養(yǎng)分析：上清樣本：細(xì)胞活力通過(guò)每日測(cè)量肝臟和近曲小管屏障隔室中的上清液的乳酸脫氫酶（LDH）活性來(lái)監(jiān)測(cè)。代謝活性通過(guò)使用乳酸比色測(cè)定試劑盒（Biovision, 美國(guó)加州米爾皮塔斯）根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，每日測(cè)量?jī)蓚€(gè)隔室上清液中的葡萄糖和乳酸水平來(lái)檢測(cè)。在第1天、第7天和第14天，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析代用血循環(huán)中CsA和RFP的濃度，并檢測(cè)兩個(gè)隔室上清液中的毒性生物標(biāo)志物。包括LDH、葡萄糖、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、N-乙酰-β-D-葡萄糖胺苷酶（NAG）、總膽紅素（TBiL）、白蛋白（ALB, 血清）、肌酐（CRE）和尿素（UREA）的生物標(biāo)志物的檢測(cè)，使用日立7180自動(dòng)生化分析儀（日本）進(jìn)行。上述標(biāo)記的試劑盒從Wako（日本）購(gòu)買(mǎi)。骨活素（OA）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶α（GST-α）、KIM-1、脂肪酸結(jié)合蛋白-1（FABP-1）、IV型膠原（Col IV）、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂鈣蛋白（NGAL）、集落素（Clu）、胱抑素C（Cys C）、腎素（REN）、α1-微球蛋白（α1-MG）、骨橋蛋白（OPN）、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂鈣蛋白（NGAL）、鈣結(jié)合蛋白（CALB）、金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（IP-10）、三葉因子-3（TFF-3）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和尿白蛋白的測(cè)定使用的是Merck Millipore（美國(guó)馬薩諸塞州比勒瑞卡）的MILLIPLEX MAP人類腎損傷磁珠板1和2。根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)，這些檢測(cè)在美國(guó)德州的Luminex 200上執(zhí)行。數(shù)據(jù)通過(guò)MILLIPLEX Analyst 5.1軟件（美國(guó)馬薩諸塞州比勒瑞卡）分析。

給藥前后進(jìn)行組織培養(yǎng)分析：含RPTEC/TERT1細(xì)胞的肝球體和膜被冷凍在O.C.T.化合物中，并儲(chǔ)存在-80°C直至進(jìn)一步分析。為了染色，切片先用-20°C的丙酮固定10分鐘或4%的PFA固定10分鐘。然后，細(xì)胞用0.05%的Triton X-100滲透處理，清洗并用10%的山羊血清封閉30分鐘，隨后用針對(duì)CYP3A4、BSEP、CK8/18、MRP-2、Na+-K+-ATP酶、P-gp、VIM、ZO-1、CLDN 10 和Ki67（所有來(lái)自Abcam，美國(guó)馬薩諸塞州劍橋）的一抗在4°C過(guò)夜或常溫下孵育2小時(shí)，或使用乙酰化微管蛋白（來(lái)自Sigma-Aldrich, 美國(guó)密蘇里州圣路易斯）孵育。之后，切片清洗三次，繼續(xù)與熒光標(biāo)記的二抗在常溫下孵育1小時(shí)。核用DAPI（Sigma-Aldrich, 美國(guó)密蘇里州圣路易斯）進(jìn)行染色。
       增殖和凋亡通過(guò)TUNEL/Ki67的免疫熒光染色進(jìn)行分析。簡(jiǎn)而言之，切片使用TUNEL技術(shù)（ApopTag1 過(guò)氧化物酶原位凋亡檢測(cè)套裝，Merck Millipore, 德國(guó)達(dá)姆施塔特）按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)進(jìn)行染色。核用DAPI進(jìn)行對(duì)染。所有的免疫熒光圖像均使用尼康Eclipse 80i數(shù)字熒光顯微鏡（日本東京）和奧林巴斯IX 71倒置顯微鏡（日本東京）配合Image-Pro Plus軟件（版本6.0, Media Cybernetics Inc., 美國(guó)馬里蘭）獲取。
        肝球體和近曲小管細(xì)胞中的總RNA使用RNeasy@ Micro Kit（Qiagen, 德國(guó)杜塞爾多夫）提取。cDNA合成使用FastQuant RT Kit（含gDNase）（Tiangen Biotech; 中國(guó)北京）。qRT-PCR擴(kuò)增在Line Gene 9620模型FQD-96A（Bioer）上進(jìn)行，使用SYBR Green檢測(cè)（Tiangen Biotech; 中國(guó)北京）。程序根據(jù)套件的生產(chǎn)商指導(dǎo)書(shū)及設(shè)備中包含的軟件執(zhí)行。數(shù)據(jù)分析使用軟件版本2.0.6進(jìn)行。mRNA水平的變化通過(guò)2-ΔΔCT方法確定。引物由Sangon Biotech（中國(guó)北京）購(gòu)買(mǎi)。TBP和β-actin是肝球體和近曲小管屏障的內(nèi)參基因。目標(biāo)基因的引物序列在補(bǔ)充材料表1中顯示。

統(tǒng)計(jì)分析：統(tǒng)計(jì)評(píng)估使用GraphPad Prism（版本6.0，美國(guó)加州圣地亞哥）和SPSS（版本17.0；IBM，美國(guó)紐約阿蒙克）進(jìn)行。P值通過(guò)單向方差分析后，學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算得出。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行了三次重復(fù)（對(duì)照組和低劑量組）或四次重復(fù)（高劑量和聯(lián)合給藥組）。除非另有說(shuō)明，所有數(shù)據(jù)均以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差呈現(xiàn)。

Received: 18 November 2019; Accepted: 15 April 2020

Published: 1 June 2020